梯度胶电泳——蛋白条带为何越跑越锐利

点击次数： 更新时间：2024-04-30

还有两个月就要迎来毕业季，各位准硕士、准博士们想必已经做完了实验，正在整理数据，全力准备答辩，在这里预祝各位准毕业生们毕业顺利。

做了多年WB实验的同学们想必非常熟悉SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）了。在传统的SDS-PAGE中，我们按传统方式配制分层凝胶，先向胶板中灌入分层胶，待分层胶凝固之后再向其中加入浓缩胶，插上用于分隔上样孔的梳子之后等待浓缩胶凝固之后便可以使用。凝固的聚丙烯酰胺形成了一张三维立体的网，网眼的疏密与凝胶的密度相关，浓度越高，网眼越密集，蛋白电泳的速度越慢。蛋白先从浓缩胶中经过，浓缩胶中的pH值较低，各种不同大小的蛋白以相近的速度泳动，并不断堆叠压缩，待条带宽度被压缩到合适的程度，再进入分离胶中，分离胶的pH值较高，SDS-蛋白复合物根据分子量的大小带上均匀的负电荷，每单位分子量所受的电场力是相当的，因此在电泳中以分子量大小为基准分离成各个条带，并基本保持了浓缩胶压缩之后的形状。

分层胶电泳原理示意

当我们使用分层胶进行电泳时，电压通常不能过大，电泳的总产热量正比于电压的平方，而过热会导致条带的宽度变宽，与背景的对比度降低，进而降低条带的分辨率。所以分层胶电泳通常是比较缓慢的，一般需要90分钟或以上的时间。并且需要根据不同大小的蛋白使用各种不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶。

那么我们有办法在提高电压加快电泳速度的同时还能够使条带压缩得更好，分辨率更高吗？使用梯度胶不失为一种好办法。

垂直电泳中梯度胶是指从上到下聚丙烯酰胺浓度不断增大的凝胶，常用的梯度胶浓度范围为4~12%、4~15%、4~18%及4~20%。梯度胶可以将不同大小的蛋白均匀地分离开，4~20%的梯度胶可以覆盖绝大多数常见的蛋白电泳分离需求，将不同大小的蛋白在不同浓度的区域进行分离。除了有利于广分子量范围的蛋白条带分离，梯度胶还有一个重要的性质——蛋白条带的自压缩。

不知道各位读者有没有见过海浪，仔细观察会发现海浪的形状几乎总是和海岸基线的形状相同的，近岸的海浪总是平行于海岸的。

海岸边一波波涌来的海浪

这是由于海浪作为有限振幅波，其运动速度与海水的深度相关，因为海水越浅，波的振动与传播受到海底泥沙砂石等固体的影响，就会越慢。当海浪靠近海岸时，前排的海浪会受到越来越浅的海水的影响，移动速度逐渐降低，后续的海浪则会缩短与前排海浪的距离，直到它们的波前重叠在一起，此时海浪的波前线的形状就与海水的等深线重合，也与海岸基线重合（因为通常离海岸基线越远的海水越深）。

海浪由于越来越大的运行阻力而不断重叠，与海岸基线保持平行的现象，和梯度胶中蛋白自压缩的现象颇为相似。梯度胶中蛋白从上到下电泳，不断从阻力较小的低浓度区域泳动至阻力较大的高浓度区域，并不断被减速，此时相同大小的蛋白所形成的较宽的条带中，靠后的蛋白处于浓度较低的区域中，泳动速度较快，而靠前的蛋白则位于浓度较高的区域中，泳动速度较慢，随着电泳的持续进行，靠后的蛋白就会缩短与靠前的蛋白的距离，直到与其重叠，此时条带的形状与梯度胶的等浓度线重合，条带也被压缩到非常窄的区域内。

这便是梯度胶电泳中的蛋白条带自压缩现象。由于自压缩所带来的全程压缩，梯度胶可以不用灌制浓缩胶（当然也可以结合浓缩胶和梯度胶来进一步提高压缩效果），并全程使用200V或以上的高电压进行电泳，电泳时间也可以缩短到50min左右，与此同时也能够保持较好的条带宽度、对比度，电泳条带锐利清晰，提高蛋白条带的分辨率。

在实验室中手动灌制梯度胶是比较困难的，所以各位读者可以选用中科通仪自动梯度制胶仪进行制作，一键灌装，省心省力，助力您的科研事业。

中科通仪自动梯度制胶仪

4~18%梯度胶电泳效果示意图

上文中通过海浪给各位读者一个形象描述梯度胶自压缩特性的方式，其实类似的现象在很多情况中都有发生，有时未必是好事，譬如在战斗机以亚音速飞行的过程中，战斗机机头推动空气在机身前方形成了一个空气的高压区，机身高速运动所发出的各种噪声以密度波的形式以声速向前方传播，而高压区中的当地声速高于机头高压区更前方还未被扰动的空气中的声速，此时不断因为速度更快而追上机头高压区的声波便堆积形成了一堵以声速运动、高温高压的空气墙，也就是所谓的音障，这极大地阻碍了战斗机的进一步提速，同时也会对机身的材料及结构刚性提出更高要求。

即将突破音障的超音速战机

从亚音速飞行的战斗机前方的音障，到平行于海岸传播的海浪，再到梯度胶中自压缩的蛋白条带，物理学的原理无分大小，规制着整个物质世界的运行。

感谢各位读者的阅读，再次预祝各位准毕业生们顺利毕业，前方一路坦途。

上一条：牛骨块研磨对比实验分享

下一条：⚠ 液氮罐安全使用小贴示